Enzymen
 

welkom op de homepage van Benno Beukema

 

Enzymen

 

Definitie:

Enzym (Grieks: enzym; en = in, zumŤ = zuurdeeg, gist; enzym = in zuurdeeg); de oude naam voor enzym  is "ferment".
( Ferment: de stof die gisting veroorzaakt =enzym; Fermentatie = gisting ).

Op een kleine groep RNA moleculen na, zijn enzymen eiwitten die werken als een biologische katalysator, dwz. versneller van (bio)chemische processen die zich in levende organismen afspelen.
( RNA: ribonucleic acid - ribonucleÔnezuur ).


Een groot deel van de kleine groep RNA moleculen ( ribozymen of RNA enzymen) katalyseren of de eigen splitsing of de splitsing van andere RNA's, maar ze kunnen ook de aminotransferase-activiteit van ribosomen activeren.
Wetenschappers hebben in het laboratorium zelfs ribozymen kunnen produceren die onder specifieke condities in staat zijn de eigen synthese te katalyseren.

Enkele bekende ribozymen zijn: ribonuclease;  groep I en groep II introns;  hammerhead,
hairpin and hepatitis delta virus (HDV) ribozymes ( Human Molecular Genetics ).
 

Historie:

  • Ongeveer 10.000 voor Christus: Fermentatie; het proces dat tot de ontdekking van enzymen leidde.
     
  • 2000 voor Christus: Egyptenaren en Sumerianen ontwikkelen fermentatie voor gebruik in brouwen, brood bakken en het maken van kaas.
     
  • 800 voor Christus: de magen van kalveren en het enzym chymosine werden gebruikt om kaas te maken.
     
  • Middeleeuwen: alchemisten identificeren alcohol als product van fermentatie.
     
  • Alcoholische fermentatie is ontegenzeggelijk de oudste bekendste enzym reactie. Deze en andere fenomenen werden tot 1857 gedacht spontane reacties te zijn. In 1857 concludeerde de Franse chemicus Louis Pasteur dat alcoholische fermentatie  wordt gekatalyseerd door "fermenten" en alleen plaatsvindt in de aanwezigheid van levende cellen. Vervolgens echter, ontdekte de Duitse chemicus Eduard Buchner in 1897 dat een celvrij extract van gist alcoholische fermentatie kan veroorzaken. De oude puzzel was nu opgelost....; de gistcellen produceren het enzym en het enzym laat de fermentatie verlopen.

pasteur

Buchner


Louis Pasteur
 


Eduard Buchner
 

  • In 1833 rapporteerde Anselme Payen (  1795 Parijs - 1871 Parijs  ) samen met de chemicus en farmacoloog Jean- FranÁois Persoz (1805 Cortaillod - 1868 Paris)  de winning van een substantie uit een malt-extract die de eigenschap bezat zetmeel om te zetten in glucose. Hij noemde deze substantie
    "diastase "  ( Grieks: diastasis = scheiden ).
    Diastase was het eerste enzym dat in geconcentreerde vorm geprepareerd werd.
    Onder diastase wordt tegenwoordig verstaan: alpha-amylase, beta-amylase en gamma-amylase.

    α-Amylase EC 3.2.1.1 ( officiŽle naam )
    Alternatieve namen: 1,4-alpha-D-glucan glucanohydrolase;  Glycogenase.

    β-amylase  EC 3.2.1.2
    Alternatieve namen:
    1,4-alpha-D-glucan maltohydrolase; Glycogenase; Saccharogen amylase

    Glucan 1,4-alpha-glucosidase   EC 3.2.1.3
    alternatieve namen: γ-amylase;
    1,4-alpha-D-glucan glucohydrolase; Lysosomal alpha-glucosidase

 

Payen

Anselme Payen

  • De Zweedse chemicus Jons Jakob Berzelius (1779Ė1848) verrichtte reeds in 1835 een van de eerste onderzoeken en noemde de chemische actie van enzymen katalytisch.

    Berzelius: The concept of catalysis:

    "The catalytic force is reflected in the capacity that some substances have, by their mere presence and not by their own reactivity, to promote changes in otherwise stable and unreactive molecules...
    ... in living plants and animals, thousands of catalytic  processes occur within the tissues and fluids,
    generating a multitude of substances of differing chemical compositions..."

 

Berzelius

Jons Jakob Berzelius

(1779Ė1848)

  • Bij zijn onderzoek naar verteringsprocessen isoleerde Theodor Schwann in 1836 een substantie die verantwoordelijk was voor de eiwithoudende vertering in de maag en noemde deze substantie pepsine.
    Pepsine ( Grieks: pepsis = verteren).
    EC 3.4.23.1  officiŽle naam: Pepsin A
    Alternatieve naam: Pepsin.

Theodor Schwann ( 1810 - 1882 )


 

  • De Duitse fysioloog Wilhelm Friedrich KŁhne (1837-1900) vond in 1867 een substantie in pancreassap die andere biologische substanties afbrak.
    Deze substantie noemde hij "Trypsine". ( Eng: trypsin EC 3.4.21.4)
    KŁhne stelde voor de biokatalysatoren "enzymen" te noemen. ( De naam "ferment" en "enzym" zijn aan gist gerelateerd).

     

Kuhne

Wilhelm Friedrich KŁhne
 

  • In 1874 vervaardigde Hansen chymosine uit de magen van kalveren voor de productie van kaas.

     
  • In 1883 ontwikkelde Johan Kjeldahl een analytische methode om stikstof te detecteren in bepaalde organische stoffen. Deze methode was de basis voor de ontwikkeling van de kwantitatieve enzymologie en algemene biotechnologie.

Johan Kjeldahl ( 1849 - 1900  )

 

  • In dit zelfde jaar (1883) ontdekte en ontwikkelde Emil Christian Hansen  een methode om gist te vermeerderen, waarna het mogelijk werd gist te produceren voor industrieel gebruik.
     



Emil Christian Hansen ( 8 mei 1842 - 27 augustus 1909 )

 

  • Emil Hermann Fischer, die zijn onderzoek in suikers in 1883 begon, stelde de moleculaire structuur van fructose, glucose en vele andere suikers vast. Tijdens zijn stereochemisch onderzoek stelde hij vast dat er twee soorten suiker zijn: D-suikers en L-suikers. ( D = dextro =rechts en  L= Levo = links). 

    D-Glucose en L-Glucose

    Hij onderzocht de reacties en de substanties die betrokken zijn bij de fermentatie en legde tijdens zijn onderzoeken hoe enzymen suikers afbreken de grondslag voor de enzymchemie.
    De specifieke actie van een enzym met een enkel substraat kan worden uitgelegd volgens de "slot en sleutel" theorie. Dit "slot en sleutel" verhaal werd voor het eerst gepostuleerd door Fischer in 1895.
    In dit verhaal is een enzym een slot en het substraat een sleutel. Alleen de juiste sleutel (substraat) past in het juiste slot (enzym).

    ( "... the intimate contact between the molecules ... is possible only with similar geometrical configurations. To use a picture, I would say that the enzyme and the substrate must fit together like a lock and key."

    Emil Fischer, 1895 )

    Fischer

    Emil Hermann Fischer (1852-1919)

 

Slot en sleutel

 

 

  • Later bleek dat het slot en sleutel verhaal niet geheel correct is. Het is nu bekend dat de actieve zijde  van enzymen vormen hebben die corresponderen met vormen van het substraat nadat het substraat gebonden is. Men heeft een aangepaste theorie voorgesteld: "The induced fit"  theorie. Deze theorie neemt aan dat het substraat een rol speelt bij de uiteindelijke vorm van het enzym en dat het enzym gedeeltelijk flexibel is en werd in 1958 beschreven door Daniel E. Koshland Jr

Daniel E. Koshland Jr.  30 maart 1920 - 23 juli 2007

 

  • Wilhelm Ostwald definieerde in 1893 katalysatoren en enzymen en bevestigde de katalytische theorieŽn van Jons Jakob Berzelius.

Wilhelm Ostwald (1853 - 1932 )

 

  • Jokichi Takamine was de eerste persoon die een enzym uit een microbische bron vervaardigde.  Hij vervaardigde taka-diastase uit Aspergillus ( schimmelgeslacht) als een verteringsenzym in 1894.

     

Dr. Jokichi Takamine: Japanese Father of American Biotechnology
 

  • In 1926 werd het eerste enzym in pure vorm verkregen. Dit feit werd volbracht door James B. Sumner van de Cornell University. Sumner was in staat om het enzym urease uit een vrucht van de broodvruchtboom te isoleren en te kristalliseren. Hiervoor kreeg hij in 1946 de Nobelprijs.
    Sumner suggereerde, in tegenstelling tot de heersende opvattingen, dat enzymen eiwitten zijn. De meeste critici in die tijd geloofden dat pure enzymen geen eiwitten bevatten.
     
  • John H. Northrop en Wendell M. Stanley van de Rockefeller Institute for Medical Research deelden de Nobelprijs met Sumner. Zij ontdekten een complexe procedure om pepsine te isoleren.
    Deze precipitatie techniek die bedacht is door  Northrop and Stanley werd gebruikt om verschillende enzymen te kristalliseren.
    Behalve pepsine, kristalliseerde Northrop ook trypsine en chymotrypsine; daarbij aantonend dat deze enzymen eiwitten zijn.

     

    Sumner

    Northrop

    Stanley


    James B. Sumner


    John H. Northrop


    Wendell M. Stanley



    ( Pepsine, een mengsel van eiwitsplitsende enzymen. Het wordt in de maag gevormd uit het eiwit pepsinogeen. Het breekt eiwitten af tot vrij grote peptidebrokstukken waarvan verdere afbraak plaatsvindt in de dunne darm)

    Pepsin A: EC 3.4.23.1 ; Pepsin B: EC 3.4.23.2 ; Pepsin C: EC 3.4.23.3

    Chymotrypsin:  EC 3.4.21.1Chymotrypsin C EC 3.4.21.2

    Link: The Nobel Prize in Chemistry 1946


     

 

Enzymen:

Enzymen zijn producten van de levende cel.
Het unieke van een levende cel is, dat deze in staat is een grote verscheidenheid aan reacties met grote efficiŽntie en specificiteit ondanks de milde fysiologische omstandigheden (lage temperatuur neutrale pH) te laten verlopen.

De belangrijkste stoffen die zorg dragen voor de processen in de cel zijn de enzymen. De verbindingen die door de enzymen worden omgezet noemt men substraten.

Enzymen zijn eiwitten die door het lichaam zelf worden aangemaakt uit deeltjes van eiwit afkomstig uit de voeding. Meestal is een enzym een zogenaamd samengesteld eiwit, dat wil zeggen een eiwit chemisch verbonden met een niet-eiwit, dat als coŽnzym of als activator kan optreden.

Een enzym is een splitsings - of ontledingsstof, die een bepaald scheikundig proces in het organisme veroorzaakt of bevordert, zonder zelf te veranderen. Enzymen zijn biochemische katalysatoren zonder welke een stofwisseling en spijsvertering onmogelijk zouden zijn.

Enzymen zijn zeer specifiek. Dat wil zeggen dat voor ieder substraat een apart enzym nodig is. Voor de werking zijn enzymen o.a. afhankelijk van de temperatuur en de zuurgraad. De meeste enzymen katalyseren processen met een snelheid van 1 tot 10.000 omzettingen per seconde per enzymmolecuul.

De snelheid van de enzymatische reactie neemt toe naarmate de hoeveelheid actief enzym groter is. Door een nauwgezette regulatie van de actieve hoeveelheid van elk enzym is de levende cel in staat het verloop van elke reactie te reguleren en hierdoor wordt een strakke coŲrdinatie van alle chemische reacties mogelijk.

Aangezien vrijwel alle biologische processen (synthese, groei, uitscheiding e.d.) door enzymen gekatalyseerd worden, worden de fysiologische eigenschappen of het karakter van een levend organisme (van een levende cel) bepaald door de enzymen die erin aanwezig zijn. Dat een levercel zich blijft gedragen als een levercel en nooit als een niercel (hoewel beide zijn ontstaan uit ťťn enkele eicel) vloeit dus voort uit het feit dat een levercel een bepaalde verzameling enzymen bezit en een niercel een andere verzameling enzymen. Dat een bepaalde cel bepaalde enzymen wel en andere niet bezit, komt doordat die cel alleen die bepaalde enzymen kan produceren.

Enzymen en coŽnzymen hebben slechts een beperkte levensduur en ze moeten op tijd vervangen worden. Daarom moeten er in het dieet voldoende aminozuren, vitaminen en metaalionen aanwezig zijn om de afgebroken enzymen en coŽnzymen tijdig te kunnen vervangen.

Vitaminen zijn organische moleculen die onmisbaar zijn voor de opbouw van enzymen en coŽnzymen die niet door het organisme zelf gemaakt kunnen worden. Daardoor is het noodzakelijk dat ze via het voedsel worden opgenomen.

De mens heeft eveneens slechts een beperkte mogelijkheid om essentiŽle metaalionen op te slaan, en de biologische labiliteit van de meeste metallo-enzymen vereist dat ook deze ionen dagelijks via ons voedsel worden opgenomen.

 

Werking:

Voor de werking van de enzymen is het interne milieu van de levende cel niet vereist. Ze kunnen dus na verbreking van de celstructuur worden geÔsoleerd en gezuiverd en in de reageerbuis (in vitro) worden bestudeerd. Hieruit blijkt dat de katalytische eigenschappen van de enzymen verankerd zijn in hun structuur.

Het is gebleken dat het overgrote deel van de enzymen behoort tot de eiwitten. Dankzij de sterk toegenomen kennis van de eiwitstructuur is het mogelijk geworden de uitzonderlijke eigenschappen van de enzymen te verklaren en te voorspellen. Een eiwit blijkt te zijn opgebouwd uit een groot aantal verschillende bouwstenen (aminozuren), die in een vaste, specifieke volgorde aaneengeregen zijn. De specifieke volgorde van de aminozuren in de eiwitketen is bepalend voor de wijze waarop de ketens bij gegeven pH e.d. ruimtelijk worden opgevouwen. Uitsluitend aan de aldus voorgeschreven ruimtelijke structuur danken de enzymen hun specifieke eigenschappen. Verlies van deze ruimtelijke structuur (denaturatie) leidt dan ook tot activiteitsverlies.

Een enzym gaat met de om te zetten verbinding (het substraat) een complex aan, dat na afloop van de reactie weer uiteenvalt in product en onveranderd enzym. De binding van het substraat vindt plaats aan ťťn bepaalde plek op het ruimtelijk eiwitbouwsel, het actieve centrum. De rangschikking van de aminozuren in en rondom dit actieve centrum is verantwoordelijk voor het katalytisch effect en de goede rangschikking van de bij de activiteit betrokken aminozuren is alleen bij de ene, unieke ruimtelijke eiwitstructuur gerealiseerd.

De ruimtelijke opvouwing van een eiwitketen is onder meer afhankelijk van de pH (zuurgraad) en dit verklaart de sterke pH-afhankelijkheid van de enzymatische activiteit. De meeste enzymen zijn slechts in een zeer beperkt pH-gebied optimaal actief (het optimum ligt doorgaans bij pH 5Ė8). Buiten dit pH-gebied verliezen de enzymen, soms op irreversibele wijze, hun activiteit.

De effecten van een verandering in temperatuur kunnen worden verklaard op basis van de kinetische theorie: een toename in temperatuur doet de moleculen sneller bewegen waarbij er dus meer botsingen plaatsvinden tussen de moleculen. Dit houdt in dat binnen een bepaalde grens ( vaak 0 - 45 C ) de snelheid van de reactie proportioneel is aan de temperatuur. Bij temperaturen boven normaal  ( zeg 60 C ) zullen enzymen denatureren; dat wil zeggen dat onder invloed van de hoge snelheid de vorm en ruimtelijke opvouwing zullen veranderen waardoor het enzym zijn werking verliest.
Bij steeds lager wordende temperaturen zullen de moleculen steeds minder snel bewegen en dus minder actief worden.

In vele gevallen kan de katalytische werking van de enzymen worden verhoogd door bepaalde stoffen, die activatoren worden genoemd. Voorbeelden hiervan zijn thiolverbindingen (zoals mercapto-ethanol en cysteÔne), maar ook tweewaardige metaalionen (Mg2+, Mn2+, Zn 2+ e.d.). Daarnaast zijn er stoffen die de activiteit van de enzymen al of niet reversibel verlagen (inhibitoren of remmers).

Allostere enzymen zijn enzymen waarvan de katalytische activiteit specifiek beÔnvloedbaar is door bepaalde metabolieten. Deze laatste binden op een andere plaats dan het om te zetten molecuul van het enzym. Zij veranderen de structuur van het enzym zodanig dat de activiteit ůf geremd, ůf gestimuleerd wordt; deze invloed op de enzymactiviteit noemt men een allosterisch effect. Zo kunnen stofwisselingprocessen gereguleerd worden. Heel vaak wordt de activiteit van het eerste enzym uit een reactieketen allosterisch geremd door het eindproduct van de reactieketen (negatieve terugkoppeling). Zo stapelt het eindproduct zich niet op (zie ook, Pasteureffect). Met de ontdekking van de allosterische remming van enzymen (1963) zijn de namen van de Franse Nobelprijswinnaars Changeux, Jacques Monod en FranÁois Jacob onlosmakelijk verbonden.

Er bestaan ook enzymen die in meer dan ťťn structurele vorm voorkomen in ťťn en hetzelfde (hogere) organisme en toch dezelfde reactie katalyseren, zogeheten iso-enzymen. Een goed onderzocht voorbeeld is dat van melkzuurdehydrogenase, waarvan in totaal vijf verschillende vormen (iso-enzymen) voorkomen. Er zijn kleine enzymatische verschillen tussen de vormen die in de hartspier, de lever en de longen voorkomen; deze vormen beantwoorden echter aan de zeer verschillende fysiologische eisen die aan deze drie organen worden gesteld.
 

maltose-glucose

Maltose bestaat uit twee aan elkaar gebonden glucose moleculen  (1).
Het enzym Maltase (
Alpha-glucosidase )  is een proteÔne die precies zo gevormd is dat het een  maltose molecuul kan accepteren  en de binding kan verbreken.(2).
Twee glucose moleculen blijven over (3).
Een enkel  maltase enzym kan tot 1000 maltose bindingen per seconde verbreken en accepteert alleen maltose moleculen.
Alpha-glucosidase ( EC 3.2.1.20 )
Human genetic disease: Glycogen storage disease II (GSD II) ( Ziekte van Pompe )
OMIM: 232300

 

enzyme substrate

 

In de meeste chemische reacties bestaat een energiebarriŤre die overwonnen moet worden voordat de reactie plaats kan vinden. Deze barriŤre voorkomt dat complexe moleculen zoals proteÔnen en nucleÔnezuren spontaan afgebroken worden en is dus nodig voor het in stand houden van het leven.

Wanneer er echter in de cel bepaalde metabole veranderingen vereist zijn, zullen bepaalde van deze complexe moleculen afgebroken moeten worden en zal de energiebarriŤre overwonnen moeten worden.

Warmte zou de extra benodigde energie kunnen leveren ( activatie-energie genoemd ), maar de toename in temperatuur zou de cel vernietigen. Het alternatief is de verlaging van de activatie-energie spiegel door het gebruik van een katalysator. Dit is dan ook de rol die enzymen spelen. Zij reageren met het substraat waarbij een overgangscomplex wordt gevormd die minder energie vereist om de reactie te laten verlopen. Het onstabiele tussenproduct zal snel worden afgebroken tot de reactieproducten en het onveranderde enzym is vrij te reageren met andere substraat moleculen.

 

 

 Alleen een bepaald gebied van het enzym, de actieve zijde genoemd, zal aan het substraat binden. Deze actieve zijde is een gleuf of holte die gevormd wordt door het driedimensionale vouwpatroon van de proteÔne. Deze driedimensionale structuur, tezamen met de chemische en elektrische eigenschappen van de aminozuren in de actieve zijde, staan alleen bepaalde substraten toe te binden aan deze zijde, aldus de specificiteit van het enzym bepalend.  

 De synthese en de activiteit van enzymen kan worden beÔnvloed door genetische controle en de verdeling in de cel. Sommige enzymen worden niet geproduceerd door bepaalde cellen en andere worden alleen gevormd wanneer zij nodig zijn. Enzymen worden niet altijd uniform in een cel gevonden; vaak worden zij verdeeld in de nucleus, op het celmembraan of in subcellulaire structuren. De snelheid van de enzym synthese en de activiteit wordt verder beÔnvloed door hormonen, neurosecreties en andere chemische stoffen die het interne milieu van de cel beÔnvloeden.

 Omdat enzymen niet verbruikt worden in de reacties die zij katalyseren en steeds weer opnieuw gebruikt kunnen worden, is alleen een zeer kleine hoeveelheid van een enzym nodig om een reactie te katalyseren. Een typisch enzymmolecuul kan 1000 substraat moleculen per seconde omzetten. De snelheid van de enzymatische reactie neemt toe met een toenemende substraat concentratie, waarbij de maximale snelheid wordt bereikt wanneer alle actieve zijden van de enzymmoleculen zijn bezet. Het enzym is dan verzadigd waarbij de snelheid van de reactie wordt bepaald door de snelheid waarmee de actieve zijde het substraat in product kan omzetten.

 De activiteit van enzymen kan op verschillende manieren geremd worden. Competitieve remming vindt plaats wanneer moleculen die veel op de substraatmoleculen lijken, zich aan de actieve zijde binden en zo voorkomen dat het eigenlijke substraat zich aan de actieve zijde bindt. Penicilline is een competitieve remmer die de actieve zijde van een enzym blokkeert  die vele bacteriŽn gebruiken om hun celwand op te bouwen.

 Niet competitieve remming vindt plaats wanneer een remmer zich aan een enzym bindt op een locatie anders dan de actieve zijde. In sommige gevallen van niet-competitieve remming denkt men dat de inhibitor zich op zoín wijze aan het enzym bindt dat de normale actieve zijde geblokkeerd wordt. In andere gevallen denkt men dat de binding van de inhibitor de driedimensionale vorm van het enzym verandert  en zo de actieve zijde vervormt waardoor er geen reactie met het substraat kan plaatsvinden. De laatste vorm wordt allosterische remming genoemd; de plaats waar de inhibitor aan het enzym bindt, wordt de allosterische zijde genoemd. Vaak zal het eindproduct van een metabole route dienen als een allosterische inhibitor op een eerder enzym in de route. De remming van een enzym door een product van zijn eigen metabole route is een vorm negatieve feedback.

Allosterische controle kan zowel betrekking hebben op de stimulatie van de enzym actie als ook de remming. Een activatormolecuul kan aan de allosterische zijde gebonden worden en een reactie uitlokken aan de actieve zijde door de driedimensionale vorm van de actieve zijde te veranderen waarna er een substraat past die deze vormverandering zelf niet kan uitvoeren. Dit is de basis van de zogenoemde ďinduced fitĒ theorie die stelt dat de binding van een substraat of sommige andere moleculen  aan een enzym een verandering in de driedimensionale vorm veroorzaakt waarbij de activiteit verbeterd of geremd wordt. Algemene activators omvatten hormonen en de producten van eerdere enzymatische reacties. Allosterische stimulatie en remming staan de productie van energie en materialen door de cel toe wanneer zij nodig zijn en remmen de productie wanneer de toevoer voldoende is.



Regulatie:
 

Inleiding

regulatie [biochemie],  het geheel van factoren (mechanismen) dat regelend werkt op de hoeveelheid van een enzym in een cel en zijn activiteit. In iedere cel komt een groot aantal verschillende enzymen voor, die de opbouw- en afbraakprocessen van de celstofwisseling verzorgen. Voor het optimaal functioneren van een cel is het van belang dat onder alle omstandigheden slechts dŪe enzymen werkzaam zijn en in zulke mate, als met dit optimaal functioneren overeenstemt. Een algemeen regelend principe is de terugkoppeling (feedback).

Regulatie van de aanmaak van enzymen

In de erfelijke aanleg van een cel (met name in het DNA) ligt de informatie opgesloten voor de vorming van zeer veel enzymen. Vrijwel nooit wordt deze aanleg in zijn geheel - en zeker niet gelijktijdig - gerealiseerd. De voornaamste mechanismen die in de regulatie van de enzymsynthese een rol spelen, zijn de inductie en de repressie (een voorbeeld van terugkoppeling) van enzymen (dit mechanisme geldt niet voor zogenaamde constitutieve enzymen). Men spreekt in dit geval van een negatieve controle van de gen-activiteit.

Daarnaast zijn er mechanismen waarbij de binding van de RNA-polymerasen aan het genoom wordt beÔnvloed en zodoende zowel de specifieke opstarting als de stopzetting van het transcriptieproces wordt geregeld (positieve controle). Vooral bij hogere organismen komen ook mechanismen voor die de translatie van de gevormde boodschapper-RNA regelen.

Regulatie van de enzymactiviteit

Op de beÔnvloeding van de feitelijke activiteit van een gegeven hoeveelheid van een bepaald enzym oefenen de volgende factoren invloed uit:

Compartimentalisatie

In de cel komen bepaalde organellen voor (zoals celkern, mitochondriŽn) die een verschillende uitrusting aan enzymen bezitten. Een enzym in de kern kan uiteraard alleen maar actief zijn als ook zijn substraat daar voorkomt. Voorbeelden van de regulatie door compartimentalisatie zijn het pasteureffect en de werking van lysosomen.

Intrinsieke eigenschappen

Een enzym kan actiever zijn naar gelang zijn eigenschappen zoals zijn pH-optimum of zijn substraataffiniteit. Wat dit laatste betreft: als verschillende enzymen eenzelfde substraat kunnen omzetten (ieder op zijn eigen wijze), dan zal bij een lage concentratie aan substraat alleen het enzym met een grote affiniteit tot dit substraat nog actief kunnen zijn. Pas bij hogere substraatconcentraties zullen ook de andere enzymen met het substraat in interactie kunnen treden.

De aanwezigheid van activerende of remmende substanties

Belangrijk is de eindproductremming: bij de synthese van vele stoffen katalyseert een aantal enzymen een aantal opeenvolgende reacties; vaak is het eindproduct een remstof voor een enzym dat vůůr in de keten werkt. Ook dit is een voorbeeld van terugkoppeling. Dit mechanisme, waarbij normale stofwisselingsproducten (metabolieten) als remstoffen of als activatoren optreden, heeft geleid tot het herkennen van de allosterische effecten. Vele enzymen zijn in hun activiteit te reguleren doordat hun conformatie verandert in aanwezigheid van bepaalde metabolieten. Daardoor verandert zowel hun affiniteit voor het substraat als hun activiteit.

Scheiding tussen opbouw en afbraak

Doorgaans vindt in de stofwisseling de afbraak van een stof plaats langs een andere weg dan haar opbouw. De synthese van eiwitten bijv. loopt via een zeer complex systeem waarbij allerlei typen RNA betrokken zijn, terwijl de afbraak hydrolytisch (door kathepsinen) plaatsvindt. Er is dus geen eenvoudig evenwicht tussen aminozuren en eiwit, maar de opbouw en de afbraak kunnen afzonderlijk geregeld worden en naast elkaar, onderling onafhankelijk, verlopen.

 

 

Enzymstructuur:

De molecuulmassa en de structuur van enzymen kan zeer variŽren.

Ribonuclease, een enzym dat nucleÔnezuren hydrolyseert die een ribose-ring bevatten, is bijvoorbeeld een relatief klein eiwit met een molecuulmassa van 13 700 u. Het bestaat uit 1 enkele polypeptideketen van 124 aminozuureenheden.

In tegenstelling hiermee staat de ingewikkelde structuur van het enzym aldolase dat betrokken is bij het glucosemetabolisme.
Dit enzym heeft een molecuulmassa van 156 000 u en bestaat uit vier subeenheden met elk een molecuulmassa van ongeveer 40 000 u.
De polypeptideketens van leveraldolase hebben daarbij ook nog een andere primaire structuur dan de polypeptiden van dit enzym in de spieren.

Het macromoleculaire complex van pyruvaatdehydrogenase is zelfs nog groter. Dit enzym katalyseert de belangrijke omzetting van pyruvaat naar acetylcoŽnzym A.

Pyruvaatdehydrogenase is een multi-enzymcomplex waarbinnen de verschillende componenten zo sterk aan elkaar verbonden zijn dat het systeem als geheel geÔsoleerd kan worden uit verschillende weefsels.

Het complex dat uit varkenshart geÔsoleerd wordt, heeft een molecuulmassa van ongeveer 10 000 000 u en bevat 42 verschillende polypeptiden en co-factoren, die allen nodig zijn voor de biologische activiteit.
 


Enzymcofactoren:

Naast het polypeptidegedeelte hebben veel enzymen nog een niet-proteÔnecomponent nodig om hun werking te kunnen uitoefenen.

Deze component wordt een cofactor genoemd. Wanneer een cofactor nodig is, wordt het eiwitgedeelte het apoŽnzym genoemd. De cofactor kan een metaalion zijn dat complex aan het enzym gebonden is. Deze wordt dan de metaalionactivator genoemd.

 

Enkele voorbeelden van enzymen die een metaal-ion nodig hebben:

Metaal Enzym
Na sucrose α-D-glucohydrolase
K pyruvate kinase ( vereist tevens Mg)
Mg Kinases ( bijv. hexokinase, pyruvate kinase);
adenosinetriphosphatases ( bijv. myosin adenosinetriphosphatase)
Fe Catalase, peroxidase, nitrogenase
Zn alcohol dehydrogenase, carboxypeptidase, carbonic anhydrase
Mo Xanthine oxidase, nitrogenase
Cu cytochrome c oxidase, amine oxidase
Ni urease, hydrogenase, superoxide dismutase
Mn histidine ammonia lyase
V nitrogenase



Veel enzymen hebben een organisch reagens nodig om de omzetting van substraat naar product tot stand te brengen. Dit kan een verbinding zijn die bijvoorbeeld een hydride-ion, een methylgroep, of een acetylgroep overdraagt naar het substraat. Dergelijke organische verbindingen die in vergelijking met het enzym relatief klein zijn , worden coŽnzymen genoemd. Er zijn coŽnzymen voor oxidatie, reductie, alkylering, acylering, isomerisatie, decarboxylering enz.

Oxidatie is het proces waarbij elektronen worden afgestaan.
Reductie is het proces waarbij elektronen worden opgenomen.
Acylering is het proces waarbij aan een molecuul een vetzuur wordt gekoppeld.
Isomerisatie is het ontstaan van stoffen met dezelfde molekuulformule, maar met verschillende structuurformules.
Decarboxylering is het proces waarbij uit een verbinding de carboxylaatgroep verwijderd wordt.
Alkylering is het proces waarbij aan een organische verbinding een alkyl groep wordt toegevoegd.

Een coŽnzym zelf is niet specifiek voor een bepaald substraat. Het is de combinatie enzym-coŽnzym die de specificiteit bepaald.

Als een cofactor stevig aan het enzym gebonden zit door middel van covalente of coŲrdinatieverbindingen, dan wordt de cofactor een prosthetische groep genoemd.

Sommige coŽnzymen zitten stevig gebonden aan het enzym als prosthetische groep, andere komen vrij voor en kunnen door verschillende enzymen gebruikt worden.

De heemgroep is een bekend voorbeeld van een prosthetische groep en is onder meer gebonden aan de cytochromen en aan hemoglobine.
 


Nomenclatuur en indeling van enzymen:

Enzymen worden meestal benoemd naar het proces dat zij katalyseren, gevolgd door de uitgang Ėase.

Men kan de enzymen op grond van hun werking indelen in zes hoofdgroepen:

  1. Oxidoreductasen

  2. Transferasen

  3. Hydrolasen

  4. Lyasen

  5. Isomerasen

  6. Ligasen



Oxidoreductasen:

Deze enzymen katalyseren redoxprocessen.

Redoxprocessen zijn processen waarbij door elektronenoverdracht ťťn van de atoomsoorten wordt geoxideerd en een ander gereduceerd.

Oxidatie is het proces waarbij elektronen worden afgestaan en reductie is het proces waarbij elektronen worden opgenomen.

Tot de groep oxidoreductasen behoren de hydrogenasen, oxidasenreductasen, transhydrogenasen en hydroxylasen.

CoŽnzymen die bij deze groep enzymen veel voorkomen zijn NAD+ en FAD.

  • NADH dehydrogenase (ubiquinone)  EC 1.6.5.3  is een voorbeeld uit deze groep.

    Dit enzym katalyseert de reactie: NADH +  ubiquinone <=> NAD+  +  ubiquinol

    Human genetic disease:

    Deficiency of Mitochondrial Respiratory Chain Complex I 

    ( MitochondriŽle Ademhalingsketen Complex I deficiŽntie )


    Synoniemen: NADH: Q ( I ) Oxidoreductase Deficiency;  Mitochondrial Complex I Deficiency; Deficiency of Mitochondrial NADH Dehydrogenase Component of Complex I; Mitohondrial Myopathy with deficiency of respiratory chain NADH-CoQ Reductase activity.


    OMIM: 252010

    OMIM: Clinical Synopsis

    Extra Informatie:
    Complex I Homepage



Transferasen:

Deze enzymen katalyseren groepsoverdrachtsreacties zoals methyl-, carboxyl-, acyl-, amino- of  fosfaatgroepsoverdracht.

Tot deze groep behoren onder meer de transfosfatasen ( kinasen ) en de transaminasen.

Een coŽnzym dat bij de laatst genoemde een rol speelt is pyridoxaalfosfaat.

  • Guanidinoacetate N-methyltransferase EC 2.1.1.2 is een voorbeeld uit deze groep.

    Dit enzym katalyseert de reactie:

    S-adenosyl-L-methionine +  guanidinoacetate <=> S-adenosyl-L-homocysteine +  creatine

    Human genetic disease:

    Guanidinoacetate methyltransferase deficiency

    OMIM: 601240

    OMIM: Clinical Synopsis



Hydrolasen:

Deze enzymen katalyseren hydrolysereacties.

Hydrolyse is een splitsing van scheikundige verbindingen onder opneming van water.

Tot deze groep behoren de peptidasen, esterasen, glycosidasen en de fosfatasen.

Een coŽnzym is niet nodig omdat water het reagens is.



Lyasen:

Deze enzymen katalyseren de splitsing van koolstof-koolstof ( C-C ), koolstof-zuurstof ( C-O )  en koolstof-stikstof ( C-N ) bindingen door middel van eliminatiereacties.

Tot deze groep behoren de decarboxylasen en de dehydratasen.

CoŽnzymen die behulpzaam zijn bij deze categorie enzymen zijn onder meer CoŽnzym A en thiaminepyrofosfaat.

  • Fumarate hydratase EC 4.2.1.2 is een voorbeeld uit deze groep.

    Dit enzym katalyseert de reactie:  (S)-malate <=>  fumarate +  H2O

    Human genetic diseases:

    Fumarase deficiency MIM:606812

    Multiple cutaneous and uterine leiomyomata (MCUL1) MIM:150800

    Hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer (HLRCC) MIM:605839



Isomerasen:

Deze enzymen katalyseren isomerisatiereacties.

Isomeren zijn stoffen met dezelfde molekuulformule, maar met verschillende structuurformules.

Tot deze groep behoren de racemasen en de epimerasen.

  • Fosfohexose-isomerase  (Glucose-6-phosphate isomerase) EC 5.3.1.9  dat in de glycolyse de omzetting van glucose-6-fosfaat in fructose-6-fosfaat katalyseert, is een voorbeeld uit deze groep.

    Dit enzym katalyseert de reactie: D-glucose 6-phosphate <=> D-fructose 6-phosphate

    Human genetic disease:

    Glucose-6-phosphate isomerase deficiency

    OMIM: Hemolytic anemia due to phosphoglucose isomerase deficiency

     


Ligasen :

deze enzymen katalyseren de koppeling van twee substraten waarbij een binding van een koolstofatoom met een zuurstof-, stikstof-, zwavel- of een ander atoom gevormd wordt.

De energie die voor de bindingsvorming nodig is wordt meestal geleverd  door hydrolyse van ATP.

Tot deze groep behoren de synthetasen en de carboxylasen.

CoŽnzymen die bij deze categorie enzymen voorkomen zijn coŽnzym A en biotine.

  • Pyruvate carboxylase EC 6.4.1.1 is een voorbeeld uit deze groep.

    Dit enzym katalyseert de reactie:

    ATP +  pyruvate +  HCO3-  <=> ADP +  phosphate +  oxaloacetate

    Human genetic disease:

    Pyruvate carboxylase deficiency

    Synoniemen: PC Deficiency;  Ataxia with lactic acidosis II;  Leigh Syndrome due to Pyruvate Carboxylase Def.; Leigh Necrotizing Encephalopathy due to pyruvate carboxylase deficiency

    OMIM: 266150

    OMIM: Clinical Synopsis

    e-Medicine:
    Pyruvate Carboxylase Deficiency

 



Binnen deze hoofdgroepen vindt naar soort substraat of reactietype nog een verdere onderverdeling plaats in subgroepen en sub-subgroepen, waarbinnen de afzonderlijke enzymen genummerd worden.

Elke groep heeft een eigen codecijfer waardoor men de enzymen kan indelen door middel van een vierdelig codenummer. ( het enzym classificatienummer of EC nummer).

Elk volgend cijfer van het nummer geeft dus een meer gedetailleerde onderverdeling en op deze wijze is naast de triviale naam en de systematische naam nog een derde aanduiding voor een enzym mogelijk.

De systematische naam van bijvoorbeeld lactaatdehydrogenase   ( triviale naam ) is L-lactaat-NAD-oxidoreductase en het codenummer is EC 1.1.1.27.

( EC 1.1.1.27 ) 

 

 

 

Restrictie enzymen

 

Restrictie enzym of ook wel Restrictie endonuclease:

De term restrictie vindt zijn oorsprong in het feit dat deze enzymen werden ontdekt in E. coli strengen die de infectie van zekere bacteriofagen bleken te beperken.

 "Endo" in endonuclease betekent dat  een enzym binnen in een DNA-streng knipt; Grieks: endo = in - binnenin.)

Nuclease: enzymen die de hydrolyse katalyseren van phosphodiester bindingen tussen nucleÔne zuren in DNA moleculen.

Een restrictie-enzym of ook wel restrictie endonuclease genoemd,  is een proteÔne die geproduceerd wordt door bacteriŽn. Deze proteÔnen zijn in staat  DNA-moleculen op een specifieke manier in kleinere fragmenten te splitsen. Een bijzondere eigenschap van deze enzymen is bovendien dat ze een bepaalde (voor elk enzym kenmerkende) specifieke basenparen-volgorde (ook wel sequentie genoemd) (minimaal 4 basenparen) in het DNA herkennen en alleen op deze specifieke plek in het DNA de fosfodiŽsterbindingen tussen de nucleotiden hydrolyseren. (het "knippen").

Er bestaan verschillende typen restrictie enzymen en die kunnen allemaal een andere volgorde herkennen. Sommige enzymen knippen beide DNA-strengen door op dezelfde plaats (blunt end); anderen knippen de strengen schuin door, op enkele basen van elkaar verwijderd (sticky end).

 

 

Met behulp van andere enzymen, de ligasen, kunnen de verschillende fragmenten weer aan elkaar worden gelijmd. Het enzym EcoRl herkent bijvoorbeeld zes basenparen (GAATTC), terwijl het enzym Sau3AI slechts vier basenparen (GATC) herkent. De eerste wordt daarom een '6-knipper' genoemd, terwijl de tweede een '4-knipper' wordt genoemd

Een bacterie gebruikt restrictie-enzymen als een afweermechanisme tegen soortvreemd DNA, zoals bijv. het DNA van een bacteriofaag (een type virus dat specifiek bacteriŽn aantast ) die de cel infecteert. Wanneer een faag een bacterie infecteert, zal de faag zijn DNA in de bacteriŽle cel plaatsen zodat dit DNA zich kan vermeerderen. Een restrictie endonuclease voorkomt de vermeerdering van het DNA van de faag door het DNA van de faag in vele stukken te knippen. Het eigen DNA van de cel wordt tegen afbraak beschermd door enzymatische modificatie (methylering) van de specifieke herkenningsplaatsen van het restrictie-enzym. Een klein gedeelte van het bacteriofaag DNA ontsnapt eveneens aan restrictie doordat het ook specifiek gemethyleerd wordt. Een faag dat een dergelijk gemodificeerd DNA bevat, vermenigvuldigt zich, bij een tweede infectie van dezelfde gastheer, veel beter dan het oorspronkelijke faag met ongemodificeerd DNA.

Er zijn veel bacteriestam specifieke restrictie-enzymen. Alleen bacteriofagen, die uit dezelfde bacteriestammen komen hebben de mogelijkheid de methylering te omzeilen en kunnen zich zo in de bacterie vermeerderen. De vermeerdering is dus beperkt tot deze stammen, vandaar de naam restrictie-enzym.

Voor hun grondleggend onderzoek naar restrictie-enzymen en hun toepassing in de moleculaire biologie kregen Werner Arber Daniel Nathans en Hamilton Othanel Smith in 1978 de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde.

Overzicht restrictie endonucleasen: New England BioLabs.

 

Typen:

Er zijn drie typen restrictie-enzymen, type I, II en III genoemd.  

Type I enzymen zijn complexe, multisubunit, combinatie restrictie- en Ėmodificerings enzymen  die het DNA op een willekeurige plaats ver van de herkenningsplaats knippen.

Type II knipt het DNA op bepaalde plaatsen dicht bij of binnen de herkenningsplaats.

Type III enzymen zijn net als type I enzymen grote enzymcomplexen die het DNA ongeveer 20 tot 25 baseparen van de herkenningsplaats verwijderd knippen.

 

Type I en III enzymen zijn gelijk in de zin dat zowel de restrictie als de methylase activiteit worden uitgevoerd door een groot enzymcomplex, dit in tegenstelling tot type II waarbij de restrictie enzym onafhankelijk is van de methylase activiteit.

In het dagelijks leven wordt meestal met restrictie-enzym type II bedoeld, omdat de andere twee typen van minder belang zijn in de moleculaire biologie. De naam van een restrictie-enzym geeft de herkomst aan. Het enzym EcoRI bijvoorbeeld is het eerst gevonden enzym uit de stam Escherichia coli R en AluI is het eerste enzym uit Arthrobacter luteus. Restrictie-enzym, die opdezelfde plaatsen knippen maar afkomstig zijn uit verschillende organismen worden isoschizomeren genoemd; knippen ze in dezelfde sequentie, maar zijn de knipeinden verschillend dan worden ze neoschizomeren genoemd.

 

Toepassingen:

Nathans was de eerste die besefte dat type II-restrictie-enzymen een zeer belangrijk gereedschap kon zijn bij het onderzoek naar de organisatie van genen op het DNA.
Met deze enzymen, waarvan er inmiddels meer dan 3000 zijn geÔsoleerd, met elk hun eigen herkenningsvolgorde, is het mogelijk lange DNA-moleculen reproduceerbaar in precies gedefinieerde fragmenten (restrictiefragmenten) te knippen.

Men kan een restrictie-analyse uitvoeren door de fragmenten op lengte te scheiden met behulp van elektroforese in agarose of polyacrylamide.
De resultaten worden verwerkt tot een restrictiekaart waarop de onderlinge ligging en afstand van de knipplaatsen van de verschillende restrictie-enzymen (restrictie-plaatsen) zijn aangegeven.
Een dergelijke restrictiekaart kan ook worden opgesteld voor de restrictiefragmenten van ťťn individueel gen. Dit is een belangrijk hulpmiddel bij het ophelderen van de fijnstructuur (nucleotidenvolgorde) van het gen.
Daartoe worden de verschillende fragmenten van het gen, met behulp van de recombinant DNA-techniek, afzonderlijk gekloneerd en wordt hun nucleotidenvolgorde bepaald.

Het functioneren van het gen kan worden bestudeerd door specifieke fragmenten te verwijderen, te vervangen door andere of te muteren. Type II-restrictie-enzymen vormt dan ook een van de pijlers waarop het hedendaagse DNA-onderzoek rust. Tussen individuen van dezelfde soort bestaan soms kleine verschillen in de restrictiekaart van een bepaald stuk DNA als gevolg van ťťn of meer mutaties die restrictieplaatsen hebben vernietigd of nieuwe plaatsen hebben gecreŽerd. Dit restrictiefragment lengte polyformisme (RFLP) kan onder meer worden gebruikt als hulpmiddel bij het geven van een genetisch advies.
Is eenmaal vastgesteld dat in een familie een bepaald restrictiepatroon gecorreleerd is met de aanwezigheid van een (recessieve) mutatie die een erfelijke afwijking veroorzaakt, dan kan middels restrictie-analyse worden bepaald of de betreffende ouder mogelijk drager van deze mutatie is; ook prenatale diagnose is langs deze weg mogelijk.

 

Indeling type II restrictie endonucleasen:

Het hoofdcriterium voor de indeling als een type II restrictie enzym is:

  • De enzymen knippen het DNA op bepaalde plaatsen dicht bij of binnen de herkenningsplaats.
     

  • De activiteit van het enzym vereist geen ATP hydrolyse

Omdat vele type II enzymen niet aan deze beperkte definitie voldoen is het nodig een aantal subindelingen te definieren:

 

Table 1. Subtypes of Type II REases
Subtypea Defining feature Examples Recognition sequence

A Asymmetric recognition sequence FokI GGATG (9/13)
    AciI CCGC (Ė3/Ė1)
B Cleaves both sides of target on both strands BcgI (10/12) CGANNNNNNTGC (12/10)
C Symmetric or asymmetric target. R and M functions in one polypeptide GsuI CTGGAG (16/14)
    HaeIV (7/13) GAYNNNNNRTC (14/9)
    BcgI (10/12) CGANNNNNNTGC (12/10)
E Two targets; one cleaved, one an effector EcoRII {downarrow}CCWGG
    NaeI GCC{downarrow}GGC
F Two targets, both cleaved coordinately SfiI GGCCNNNN{downarrow}NGGCC
    SgrAI CR{downarrow}CCGGYG
G Symmetric or asymmetric target. Affected by AdoMet BsgI GTGCAG (16/14)
    Eco57I CTGAAG (16/14)
H Symmetric or asymmetric target. Similar to Type I gene structure BcgI (10/12) CGANNNNNNTGC (12/10)
    AhdI GACNNN{downarrow}NNGTC
M Subtype IIP or IIA. Require methylated target DpnI Gm6 A{downarrow}TC
P Symmetric target and cleavage sites EcoRI G{downarrow}AATTC
    PpuMI RG{downarrow}GWCCY
    BslI CCNNNNN{downarrow}NNGG
S Asymmetric target and cleavage sites FokI GGATG (9/13)
    MmeI TCCRAC (20/18)
T Symmetric or asymmetric target. R genes are heterodimers Bpu10I CCTNAGC (Ė5/Ė2)b
    BslI CCNNNNN{downarrow}NNGG

aNote that not all subtypes are mutually exclusive. E.g. BslI is of subtype P and T.

bThe abbreviation indicates double strand cleavage as shown below:

5' C C{downarrow}T N A G C

3' G G A N T{uparrow}C G

 

 

Voorbeelden van restrictie enzymen

 

Enzyme Organism from which derived Target sequence
(cut at *)
5' -->3'
Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C
Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T
Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C
Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G
Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C
Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C
Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T
Hpa I Haemophilus parainflenzae G T T * A A C
Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C
Mbo I Moraxella bovis *G A T C
Mbo I Moraxella bovis *G A T C
Pst I Providencia stuartii C T G C A * G
Sma I Serratia marcescens C C C * G G G
SstI Streptomyces stanford G A G C T * C
Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C
Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A
Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G

 

Note: Only one strand of the target DNA is shown, in the interests of clarity. It will be noted that the omitted strand has the same sequence as the one show, but the nucleotides occur in the reverse order. Thus for example The complementary sequence for Sal I (with its point of cleavage indicated as above) is 5' -C A G C T * G-3'. These are hence said to be palindromic sequences, and double-stranded cuts produce short sinlge-stranded cohesive ends.

 

LINK: Structure and Function of Type II Restriction Endonucleases (PDF)

 

 

 

Denatureren van eiwitten

 

Bij het denatureren van eiwitten worden de secundaire, tertiaire en quaternaire structuur verbroken omdat de balans tussen alle aantrekkende en afstotende krachten in een eiwitketen verstoord wordt. Hierdoor verandert de driedimensionale vorm van het eiwit. Sommige eiwitten zijn uit de aard van hun functie vrij goed bestand tegen denaturering: bijvoorbeeld huid, haar en nagels worden niet gemakkelijk gedenatureerd omdat ze veel disulfidebruggen bevatten.
Veel enzymen daarentegen worden snel gedenatureerd wanneer hun omgeving teveel gaat afwijken van de natuurlijke omstandigheden. Door denaturering gaat de activiteit van het enzym verloren.
Denaturering kan op verschillende manieren gebeuren, bijvoorbeeld door temperatuurverhoging of pH-verandering. Meestal coaguleren (stollen) eiwitten bij het denatureren ( stremmen, uitvlokken). Een bekend voorbeeld voorbeeld van denatureren door temperatuurverhoging is het geleren van het eiwit (albumine) van een ei tijdens het koken, het inactiveren van enzymen en het doden van bacteriŽn door verhitten.
Ionen van zware metalen kunnen een eiwit denatureren omdat ze binden aan thiol-groepen waardoor het eiwit neerslaat. Ook kunnen ze complexen vormen met de carbonylgroepen in een eiwit  waardoor waterstofbruggen in het eiwit verbroken worden. Ook bestraling, ultrasone vibratie, oxidatie, reductie (verbreken S - S bruggen) en het toevoegen van detergentia of organische oplosmiddelen kan denaturering veroorzaken. De desinfecterende werking van  een 70% ethanoloplossing berust op de snelle denaturering van bacterie-eiwitten, waardoor de bacteriŽn gedood worden.

 

 

 

Klinische enzymologie

 

Dr J. Kortleven
 

Enzymen en enzyme-eenheden

Enzymen zijn katalysatoren: zij katalyseren de omvorming van een substantie (het substraat) in een andere (het product).
De concentraties van enzymen in het serum zijn te klein om bepaald te kunnen worden, en we moeten ons dan ook tevreden stellen met het meten van de activiteit van het enzyme, bepaald uit de snelheid van het verdwijnen van het substraat of het verschijnen van het produkt. We meten dus enzyme-activiteit. Enzyme-activiteit wordt uitgedrukt in internationale eenheden (I.U. = International Unit). 1 IU is de enzyme-activiteit waardoor 1 micromol substraat per minuut wordt omgezet.
De hoeveelheid omgezet substraat hangt af van de temperatuur, de pH, het type en de concentratie van het substraat. Normale waarden verschillen dan ook van labo tot labo.
Er is een zekere tendens om alle gemeten grootheden uit te drukken in SI-eenheden (SystŤme Internationale). Dan worden er geen mU/ml meer gebruikt maar katal/liter.
 

Verhoogde enzyme-activiteit

Enzyme-activiteit is in het algemeen hoog in cellen, laag in serum. Normale serum enzyme-activiteit is het gevolg van een voortdurend "uitzweten" van enzymen uit cellen en van een natuurlijke afbraak van cellen. (Enkele enzymen komen vooral of uitsluitend in serum of plasma voor (pseudocholinesterase, enzymen van de bloedstolling), of worden door exocriene klieren uitgescheiden (amylase, lipase)).

In de cellen komen de enzymen vrij voor, of gebonden aan intracellulaire organellen (microsomen, mitochondriŽn). De instandhouding van de cel vraagt een voortdurende metabole inspanning. Wanneer een cel beschadigd wordt of aan zuurstofgebrek lijdt breekt de celmembraan, en lekken intracellulaire bestanddelen het serum in. Ernstige letsels, die tot celdood leiden beschadigen ook de mitochondriŽn, en veroorzaken een vrijkomen van de mitochondriŽle enzymen.

Het stijgen van de serumenzymen kan ook voorkomen zonder celbeschadiging: gestegen aanmaak in de cel zal ook een stijging van het uitlekken uit de cel veroorzaken. Dit is het geval bij alcoholgebruik, cholestase, sommige anticonvulsiva. Hierbij ziet men de alkalische fosfatasen en de gamma-glutamyltransferase stijgen, zowel in de levercellen als in het serum.
 

Enzymen die vrijkomen in het bloed worden zeer vlug geÔnactiveerd en opgenomen in het reticuloŽndotheliaal stelsel.
 

Halfwaardetijd van enkele enzymen
GOT 17 Ī 5 uren
GPT 47 Ī 10 uren
LDH1 (HBDH) 113 Ī 60 uren
LDH5 10 Ī 2 uren
CPK Ī 15 uren
ALP 3 tot 7 dagen
GGT 3 tot 4 dagen
CHE Ī 10 uren
Amylase 3 tot 6 uren
Lipase  


 

Staalname

Enzymen kunnen bepaald worden in serum, plasma, of andere lichaamsvochten. De meeste anticoagulantia inhiberen in meerdere of mindere mate sommige enzymen, en men verkiest dan ook meestal de dosering uit te voeren op serum.

Enzymen zijn in hoge concentratie aanwezig in de cellen, ook in de rode bloedcellen, en het is dus uiterst belangrijk hemolyse te vermijden. Vooral LDH stijgt sterk bij hemolyse.

Over het algemeen zijn enzymen stabiel in serum (afgescheiden van RBC) gedurende 24 uur op kamertemperatuur, vijf dagen in de koelkast, 2 tot 3 maanden in de diepvriezer.

Natuurlijk bestaan er uitzonderingen op deze regel: zure fosfatasen verminderen zeer sterk tenzij men het serum aanzuurt of in contact laat met de bloedklonter.

Stalen voor LDH-isoŽnzymen moeten op kamertemperatuur bewaard worden: LDH5 wordt gedenatureerd bij koelkast of diepvries temperatuur.
 

PatiŽnten-variabelen

  • leeftijd en geslacht: zijn belangrijk bij de bepaling van alkalische fosfatasen: de waarden zijn verhoogd zolang er actieve beenaanmaak gebeurt. Na de leeftijd van 60 jaar stijgen de waarden, mťťr bij vrouwen dan bij mannen.
  • inspanning: spierinspanningen, vooral bij ongeoefende personen veroorzaken een stijging van LDH en GOT en hebben een massieve stijging van CPK-waarden tot gevolg. Zelfs lichte spieroefening of intramusculaire inspuitingen lokken verhoogde CPK-waarden uit.
  • medicatie: anticonvulsiva en alcoholgebruik verhogen de GGT en ALP-waarden. Ook andere waarden kunnen interfereren. Er bestaan lijsten met mogelijke interferenties.
  • voedselinname: in principe wordt bloed voor enzyme-bepalingen nuchter afgenomen. Dit is niet steeds mogelijk. Alkalische fosfatasen kunnen na voedselinname verhoogd zijn bij sommige patiŽnten.


 

Enzyme-testen als hulpmiddel bij diagnose

De concentratie van enzymen in cellen is veel hoger dan in serum, en het is dan ook begrijpelijk dat enzymtesten zeer gevoelige indicatoren zijn voor celletsels. Men mag rekenen dat enzymtesten een gevoeligheid hebben van mťťr dan 90%: dit betekent dat er zeer weinig vals-negatieve uitslagen zijn (een negatieve uitslag sluit ziekte uit).
Enzymtesten missen echter specificiteit: abnormale resultaten zijn dikwijls vals-positief, vooral als de prevalentie van de ziekte laag is.
De specificiteit kan verhoogd worden door het bepalen van isoŽnzymen: bij verschillende enzymen is de totale activiteit de som van de activiteit van meerdere fracties, die verschillen in fysico-chemische eigenschappen. Zeer dikwijls is een bepaalde fractie orgaan-specifiek. Het bepalen van de isoŽnzym-activiteit van LDH, CPK en ALP is klinisch zinvol.

 

Relatieve concentratie van enzymen intra- en extra-cellulair
 
Serum
RBC
Lever
Hart
Spier
ASAT (SGOT) 1 x 15 x 7.000 x 8.000 x 5.000
ALAT (SGPT) 1 x 7 x 3.000 x 400 x 300
LDH 1 x 300 x 1.500 x 1.000 x 700
CPK 1 x 0,1 x 0,01 x10.000 x 50.000

 

 


 

Bespreking van enkele serumenzymen

  1. Transaminasen (GOT of ASAT : glutamaat oxaalacetaat transaminase of aspartaat aminotransferase en GPT of ALAT : alanine amino-transferase of glutamaat pyruvaattransferase).

GOT komt vooral voor in hart en lever, minder in de gestreepte spieren, nieren en pancreas. Het bevindt zich zowel in het cytoplasma als in de mitochondriŽn.

GPT komt vooral in de lever voor, minder in de nieren en de skelet-spieren. Het bevindt zich vooral in het cytoplasma.

De lever bevat ongeveer driemaal zoveel GOT als GPT. Bij lichte leverbeschadiging zal vooral GPT vrijkomen en de waarden van GPT liggen dan hoger dan die voor GOT. Bij ernstige leverbeschadiging (met celnecrose) zal ook mitochondriaal GOT vrijkomen, en zal de GOT-waarde de GPT-waarde overtreffen. De verhouding tussen deze twee enzymen (De Ritis quotiŽnt = GOT/GPT) is dus een maat voor de ernst van de celbeschadiging.

Klinisch nut:

  • myocardinfarct: na myocardinfarct (6 tot 10 uur na necrose) komen grote hoeveelheden GOT in het serum vrij, met een maximum na 24 tot 48 uur. Indien er geen leverlijden is duidt een nieuwe piek op bijkomende necrose. Zware arythmieŽn en ernstige angina pectoris kunnen evenwel ook GOT-stijging veroorzaken. Ongecompliceerde hartdecompensatie of longinfarcten veroorzaken weinig verandering van de GOT-spiegels. GPT stijgt weinig of niet na infarct.
  • leverziekte: leverbeschadiging (infectieuze of toxische hepatitis, congestie, galwegenobstructie, actieve cirrose) veroorzaken een stijging van de GOT en de GPT activiteit. Bij hepatitis treedt deze stijging zeer vroeg op, gewoonlijk voor het verschijnen van de icterus. De enzyme spiegels dalen ook weer vlug en worden terug normaal nog voor totale genezing van de parenchymletsels. De GPT daalt trager dan de GOT. Obstructieve icterus, metastasen, chronische actieve cirrose veroorzaken matige stijging. Ook pancreatitis en mononucleosis infectiosa geven een matige stijging van de transaminasen. Bij cholecystitis zonder icterus blijven de transaminasen in principe normaal.
  • sommige spierziekten (progressieve musculaire dystrofie) (ook dermatomyositis) geven een matige stijging van de GOT, weinig of geen stijging van de GPT.

 

2 Lactaat dehydrogenase (LDH)

LDH komt voor in skeletspieren, lever, hart, nieren, rode bloedcellen, hersenen, tumorcellen, atypische lymfocieten. Het is dus een weinig specifiek enzyme. Zijn stijging kan wijzen op een brede waaier van aandoeningen: hemolyse, lever- of hartziekten, ook andere aandoeningen. Zijn specificiteit wordt vergroot door het scheiden van de isoŽnzymen:

LDH-isoenzymen

LDH heeft vijf isoŽnzymen: genummerd van 1 tot 5 volgens de mobiliteit in een elektrisch veld (elektroforese): de snelst bewegende fractie is LDH1: LDH1 komt vooral voor in het hart en in de rode bloedcellen (LDH1 = HBDH = Hydroxy boterzuur dehydrogenase).
Het traagste isoŽnzyme is LDH5: LDH5 komt vooral voor in de lever en de skeletspieren.
Wanneer de totale LDH-activiteit gestegen is kan men een viertal patronen herkennen: stijging van LDH1, zodat LDH1 hoger wordt dan LDH2 ("flipped") is het hart en hemolyse patroon. Stijging van LDH5 duidt op letsels van de lever of van de skeletspieren. Stijging van LDH2, LDH3 en LDH4 ("Midzone increase") wordt voornamelijk gezien bij aantasting van de bloedplaatjes of van het lymfatisch systeem. Het niet specifieke patroon (isomorf patroon) komt overeen met de normale verdeling en laat geen specifieke diagnose toe.

Op volgende afbeeldingen worden enkele typische patronen getoond. (voor het nut van LDH-isoŽnzymen bij hartinfarct: zie ook "Laboratoriumdiagnose van Acuut Myocard Infarct")

 

normaal patroon

flipped patroon

sterk verhoogd totale LDH


 

Klinisch nut:

  • Hartziekten
    LDH en LDH-isoŽnzymen worden meestal gevraagd om de diagnose van hartinfarct te kunnen stellen of te bevestigen.
    LDH stijgt relatief langzaam: de stijging begint 24 tot 72 uur na het infarct, en de hoge waarden blijven 10 tot 14 dagen bestaan.
    De verhouding van de verschillende isoŽnzymen verandert vůůr de stijging van de totale LDH- activiteit begint: men kan na 24 uur reeds een "flipped" patroon opmerken, bij normale totale LDH. Dit omkeren van het LDH-isoŽnzyme patroon is uiterst waardevol bij het stellen van de differentiŽle diagnose tussen myocardinfarct en angina pectoris.
    Longziekten hebben geen invloed op de verhouding LDH1/LDH2. Indien er bij hartziekte levercongestie optreedt worden ook een aantal levercellen beschadigd en zal ook LDH stijgen.
    Ontstekingen van de hartspier verhogen ook LDH1: myocarditis bijvoorbeeld produceert een "flippend" isoŽnzyme patroon, maar de totale LDH stijgt weinig. Ook hartoperaties veroorzaken een tijdelijke (enkele dagen) omgekeerde LDH1/LDH2 verhouding.
  • Leverziekten:
    LDH5 is het lever-isoŽnzyme. Acute hepatitis veroorzaakt een enorme LDH-stijging die volkomen voor rekening van LDH5 komt. Deze stijging begint voor het verschijnen van de icterus. LDH5 daalt vrij vlug, eerder dan bijvoorbeeld GPT.
    Ook toxische hepatitis (na geneesmiddelen) veroorzaakt een stijging van LDH5. Bij mononucleosis infectiosa stijgt de totale LDH soms zeer hoog, LDH5 stijgt slechts matig. Cholangitis en obstructieve icterus hebben slechts weinig invloed op LDH.
    Bij levermetastasen is de verhouding LDH4/LDH5 meestal groter dan 1,05. Een verhouding LDH4/LDH5 kleiner dan 1,05 wijst eerder naar primair hepatoma (hepatocellulair carcinoma).
  • bloedziekten:
    Het is zeer moeilijk een onderscheid te maken tussen de verschillende hematologische aandoeningen aan de hand van LDH-isoŽnzymen: in het algemeen is LDH1 afkomstig van de rode bloedcellen, LDH2 van de granulocieten, LDH3, 4, 5, van beschadigde lymfocieten. Lymfomen geven evenwel een stijging van LDH2.
  • andere ziekten
    Longweefsel
    is rijk aan LDH3, en bij destructie van longweefsel zal men dan ook een stijging van LDH3 zien. Interpretatie is dikwijls echter moeilijk: bij longinfarct bijvoorbeeld worden er ook een groot aantal rode bloedcellen gehemolyseerd, met stijging van, naast LDH3, ook LDH1: dan wordt de differentiŽle diagnose met hartinfarct eerder moeilijk.
    Skeletspieren bevatten vooral LDH5, met een weinig LDH4 en LDH3. Na zware spierinspanning kan het totale LDH stijgen, maar de verhouding LDH1/LDH2 blijft gelijk.
     

3. Creatinine kinase (CK of CPK : creatinine phospho-kinase)

Creatine fosfokinase komt voor in de gestreepte spieren, de hartspier, de darm en de hersenen. Na beschadiging van een gestreepte spiercel komt het CK zeer snel vrij in het serum, na hersenbeschadiging stijgt CK langzaam. Het enzyme wordt zeer vlug uit het bloed verwijderd.
CK is waarschijnlijk een van de beste indicatoren van hartinfarct: het stijgt zeer vlug en het komt zeer weinig in andere weefsels voor.
Het feit dat minimale traumata van de skeletspieren ook CK stijging kunnen veroorzaken maakt deze gevoelige indicator echter weinig specifiek: spierarbeid, een val, een intramusculaire injectie zijn voldoende om de CK-spiegels omhoog te jagen.

CK heeft drie isoŽnzymen: MM, MB, BB. Ze kunnen met verschillende technieken gescheiden worden. MM (M voor muscle) komt voor in spier- en hartweefsel. BB (B voor brain) komt voor in de hersenen. MB komt uitsluitend voor in de hartspier.
In normaal serum vindt men MM en een spoortje MB. MB komt in grote hoeveelheden in het serum na myocardinfarct. BB wordt soms gevonden na acuut hersenletsel, maagcarcinoma, prostaat carcinoma, en bij patiŽnten die chronische dialyse of coronaire bypasschirurgie ondergaan.

Wij gebruiken voor het bepalen van CK-MB een immunologische techniek waarbij alle M-componenten geÔnactiveerd worden (MM en het M-deel van MB). Daarna wordt de overblijvende activiteit gemeten, die dus (meestal) een maat is voor de activiteit van CK-MB.

 

Klinisch nut:

  • Spierziekten
    acute en voortschrijdende spiernecrose veroorzaakt een astronomische stijging van CK: deze stijging is een gevolg van de beschadiging van actieve spiervezels, en is dan ook het hoogst in het begin van de ziekte. Naarmate de spiermassa vermindert, vermindert ook de hoeveelheid circulerend CK en de enzyme activiteit heeft weinig prognostische of diagnostische waarde bij gevorderde spieraandoeningen.
    CK-activiteit is hoger dan normaal bij de meeste vrouwelijke carriers van musculaire dystrofie (Duchenne - X-chromosoom gebonden), zonder evenwel diagnostisch te zijn.
    Ook polymyositis, dermatomyositis, zware hypothyreoÔdie met spierafwijkingen geven verhoogde CK-waarden.
  • hartziekten
    de aanwezigheid van CK-MB is de meest gevoelige "marker" van myocardinfarct. CK-MB verschijnt vroeg (binnen de 24 uur na een infarct). Het stijgt niet na longembolen, hartdecompensatie, angina pectoris (men heeft evenwel ook stijging van CK-MB beschreven na spiertrauma, langdurige tachy-arythmieŽn, zeer zware angina).
    Het is waarschijnlijk niet mogelijk uit de stijging van CK-MB conclusies te trekken betreffende de omvang van het infarct: de stijging van de enzyme-activiteit in het serum hangt niet alleen af van de uitgebreidheid van de celnecrose maar ook van de relatieve concentratie CK-MB in de aangetaste vezels en van de bevloeiing van het geÔnfarcteerde deel.
    Het is belangrijk bij de diagnose van een hartinfarct een vrij strikte timing aan te houden: CK-MB is het eerste enzyme dat in meetbare hoeveelheden in het serum vrijkomt na een infarct: het kan soms aangetoond worden binnen de 3 tot 6 uur na het begin van de pijn, vůůr de stijging van het totale CK. Het maximum wordt gewoonlijk bereikt na 12 tot 24 uur, en men vindt opnieuw normale waarden na 24 tot 48 uur. Het is dan ook belangrijk een serumstaal te nemen bij opname, en controles te doen na 24 en 48 uur. Sommigen raden zelfs een bloedname om de 12 uur aan om een (eventueel kleine) stijging van CK-MB niet te missen.

 

4. Gamma Glutamyl Transferase (GGT of Gamma Glutamyl Transpeptidase,GGTP)

Gamma glutamyl transferase is een enzyme dat in hoge concentratie voorkomt in de lever en in mindere mate in de nieren. Het heeft een grote, zij het niet volledige, lever- en galwegenspecificiteit, en de bepaling is in de eerste plaats te beschouwen als een levertest.
Eigenaardig genoeg dalen de GGT-concentraties bij zwangerschap of inname van orale contraceptiva, en een patiŽnte met leverpathologie kan dus in deze omstandigheden normale GGT-waarden hebben.

Klinisch nut:

  • Leverziekten
    GGT is gestegen bij 75 tot 90 % van de patiŽnten met bewezen lever-of galwegenpathologie. De hoogste waarden komen voor waar cholestase aanwezig is: cholestatische hepatitis, extrahepatische galwegenafsluiting, levermetastasen. Bij acute hepatitis stijgt GGT trager dan de andere enzymen, tenzij er een cholestatische component aanwezig is. De activiteit blijft ook het langst verhoogd. Bij actieve cirrose (vooral bij primaire biliaire cirrose en alcoholische cirrose) en bij chronische hepatitis worden zeer hoge waarden gevonden.
    GGT is zeer gevoelig aan alcoholgebruik, en kan dus nuttig zijn bij de diagnose van chronische alcohol abusus, of het houden van een onthoudingskuur (alcohol stimuleert de produktie van GGT, en veroorzaakt bovendien cholestatische leverletsels).
  • Andere aandoeningen
    Acute pancreatitis en acute opstoten van chronische pancreatitis doen GGT stijgen.
    Sommige nierziekten (zwaar nefrotisch syndroom, rejecties bij niertransplanten, sommige maligne niertumoren) veroorzaken verhoogde GGT waarden.
    Hierbij enkele tabellen uit een artikel van J. Fevery (cfr. referenties) over GGT.
  •  

 

"Klinisch nut" van serum GGTP
Als geÔsoleerde parameter
1 Indien normaal, kan een klinisch beduidend leverlijden worden uitgesloten tenzij bij zwangerschap en contraceptiva. Normaliseert laattijdig na acute hepatitis (cfr. thymol)
2 Hoogste waarden bij alcoholisch leverlijden, cholestase (extrahepatisch intrahepatisch), levermetastasering.
3 In screening en follow-up van alcoholisme en abstinentie (t/2 = 5 - 27 dagen).
In vergelijking met andere biochemische parameters
1. GGTP
Alk. fosfatase
Bilirubine  
zeer hoog nl. of licht verhoogd   = alcohol
normaal verhoogd   = skeletpathologie placentair, zwangerschap
normaal verhoogd verhoogd = kan toxische cholestase zijn door oestrogenen of verwante steroÔden
verhoogd normaal laag normaal = enzyme inductie
verhoogd nl of licht verhoogd normaal = kan wijzen op levermeta's
minder hoog hoog zeer hoog = bij sterke cholestase
2. GGTP SGPT kan wijzen op:
minder of gelijk gestegen dan SGPT acute hepatitis
iets meer gestegen dan SGPT chronische hepatitis
laag tot normaal nog hoge SGPT slechte evolutie (fulminante hepatitis)
3. Bij cirrose  
GGTP/SGPT 30 ( 14) verwijst naar alcohol (of p. biliaire) als etiologie
GGTP/SGPT 4,5 post hepatitis

 

5. Fosfatasen

Alkalische fosfatasen

Alkalische fosfatasen komen voor in lever, beenderen, darm, placenta. De normale serumactiviteit van ALP is afkomstig van de lever en de beenderen. Bij kinderen en adolescenten predomineert vooral de beender-ALP. Intestinaal ALP komt soms in het serum na een maaltijd en placentair ALP tijdens het derde trimester van de zwangerschap. Verhoogde ALP-waarden bij nuchtere, niet zwangere volwassenen zijn meestal terug te voeren tot lever- of beenderletsels.
 

Klinisch nut:

  • beenderziekten: allerhande beenderziekten zoals ziekte van Paget, hyperparathyroidie, beenmetastasen, osteomalacie, osteo-sarcomen, hyperphosphatemie, veroorzaken stijging van ALP.
  • leverziekten: vooral leverziekten gekenmerkt door cholestase veroorzaken stijging van ALP (cfr. GGT): obstructie van de ductus communis (stenen, striktuur, tumoren); biliaire cirrose; "drug-induced" cholestatisch icterus; virale hepatitis met cholestase; infiltratie van de lever bij metastasen, sarcoidosis, lymfomen, etc. Bij chronische actieve hepatitis of levercongestie ziet men slechts zelden een stijging van ALP.
  • andere ziekten: Pancreatitis en niertumoren kunnen soms verhoogde ALP-waarden veroorzaken.

Bepaling van iso-enzymen van alkalische fosfatasen is mogelijk, maar heeft eerder beperkte indicaties.

Zure fosfatasen (ACP of Acid phosphatase)

Komt voornamelijk voor in de prostaat, in zeer geringe mate in rode bloedcellen, bloedplaatjes, etc.

Duidelijk verhoogde waarden duiden praktisch altijd op prostaatcarcinoom. Prostaathypertrofie en prostatitis veroorzaken geen verandering van de enzym-spiegels.

Na prostaatmassage, of zelfs na onderzoek van de prostaat, kan de ACP-waarde binnen enkele uren stijgen. Men raadt dan ook aan bloed voor ACP af te nemen vůůr onderzoek van de prostaat, of minstens 24 uur na het onderzoek. Prostaatinfarct, transurethrale resectie van de prostaat veroorzaken ook ACP-stijging.

Bij 19 % van patiŽnten met beendermetastasen, 2 % met levermetastasen, 6 % met tumoren zonder lever- of beenderinvasie, 10 % met primaire beenderkankers is de ACP-activiteit verhoogd. Ook bij ziekte van Paget (21 %), bij hyperparathyroidie (3/9) en sommige andere beenderziekten ziet men de ACP-waarde stijgen.

De bepaling van totale zure fosfatasen wordt niet meer uitgevoerd. Dit onderzoek is vervangen door de bepaling van tartraat-zure fosfaten en van PSA (Prostaat Specifiek Antigeen)

Meer uitleg over der verschillende testen en een verduidelijking van de nomenclatuur vindt men in "Laboratoriumonderzoeken bij prostaatkanker).

 

6. Amylase

Amylase is een enzyme dat afgescheiden wordt door sommige exocriene klieren: pancreas en speekselklieren. Veel lagere activiteit komt voor in de ovaria, de dikke en de dunne darm, spierweefsel.

Bij celbeschadiging komt niet-gesecreteerd enzyme in de bloedbaan en bij opstoppen van de afvoerwegen zal enzyme doorsijpelen naar het serum. De hoeveelheid enzyme die bij celbeschadiging vrijkomt hangt af van het trauma, en van de functionele toestand van de cellen.

Amylase wordt snel uit het serum verwijderd door de nieren.

Klinisch nut:

  • Pancreasziekten:
    stijging van serumamylasen wijst meestal op pancreaslijden. Bij acute pancreatitis stijgen de waarden binnen enkele uren.
    Amylase is een zeer kleine molecule, en het wordt zeer vlug door de nieren uit het bloed geklaard. De verhoogde waarden dalen dan ook zeer vlug: binnen 48 tot 72 uur kan de serumspiegel terug normaal zijn, terwijl de acute ontsteking doorgaat. In dit geval kan het aantonen van grote hoeveelheden amylase in de urine belangrijk zijn.
    Dalen van de amylase-spiegels kan dus wijzen op:
    • vermindering van de ontsteking.
    • uitscheiding van het enzyme door de nieren (verhoogde amylasurie).
    • functionele ineenstorting van de pancreas (er zijn geen kliercellen meer over om het enzyme aan te maken!).

Ook zonder pancreatitis kan spasme van de sfinkter van Oddi (morfine!, radioŲpake substanties!) sterke stijging van de amylase-concentraties veroorzaken.

  • Andere ziekten: bij chemische irritatie van de pancreas kunnen de waarden van amylase stijgen: geperforeerde maagzweer, galblaas empyeem, darmobstructie, geruptureerde extra-uteriene zwangerschap, peritonitis.
    De stijging van de amylasemie is hier waarschijnlijk te wijten aan pancreasirritatie of voorbijgaande pancreasontsteking, met resorptie van de enzymen door de gedilateerde bloedvaatjes.
  • Chronische pancreatitis veroorzaakt weinig stijging, carcinoma van de pancreas veroorzaakt in principe gťťn stijging van het enzyme.
  • Bij nierinsufficiŽntie wordt het enzyme niet uitgescheiden en vindt men verhoogde waarden, zonder pancreaslijden. De serumwaarden kunnnen stijgen tot 3 x de normale waarden. Hogere stijging moet doen denken aan pancreatitis. Bij kunstnierpatiŽnten is een stijging van de waarden dan ook belangrijker dan ťťn enkele verhoogde waarde.
  • Bij parotitis vinden we verhoogde amylase-waarden.

Er bestaat een abnormale vorm van het enzyme (macro-amylasemie), waarbij amylasen gebonden zijn aan een serumeiwit. Dit complex kan niet uitgescheiden worden door de nieren. De bloedspiegels van amylasen zijn dan ook verhoogd, de amylasurie is laag of normaal.

Het scheiden van amylase in verschillende isoŽnzymen is mogelijk, maar wordt zelden of nooit uitgevoerd: de differentiŽle diagnose tussen pancreas- en speekselklierlijden is gewoonlijk niet moeilijk, en bij twijfel kan het bepalen van de lipase activiteit hulp bieden.

 

7. Lipase

Lipase is een ander enzyme dat door de pancreas afgescheiden wordt in het duodenum. Het komt in het bloed na letsels van de pancreas (het enige orgaan dat lipase bevat). Lipasen worden niet uitgescheiden door de nieren, en de waarden blijven dan ook langer verhoogd.

Acute pancreatitis is de voornaamste oorzaak van verhoogde lipasemie. De waarden lopen parallel met de amylase activiteit in het begin van de ziekte, maar ze blijven langer verhoogd. Lipase kan dus helpen bij laattijdige diagnose van pancreatitis. Het is van weinig nut bij chronische pancreatitis, bij chronische galwegen aandoeningen, bij carcinoma van de pancreas. Ziekten van de speekselklieren hebben geen invloed op de waarden van de lipase.

Bij chronische nierinsufficiŽntie is de lipase-activiteit in het serum verhoogd. Deze waarde stijgt tijdens dialyse, waarschijnlijk door vetafbraak, geinduceerd door heparine. Ook hier (zoals bij amylase) is een stijging van de gevonden waarden een belangrijke aanduiding voor pancreatitis, meer dan ťťn enkele verhoogde waarde.

 

8. Cholinesterase(CHE)

Twee soorten cholinesterase zijn gekend: "echte" cholinesterase of acetyl-cholinesterase en"pseudo"cholinesterase.
Acetylcholinesterase komt voor in alle weefsels, maar vooral in de grijze hersenstof. Pseudocholinesterase wordt gevormd in de lever en komt in alle weefsels voor. Zijn juiste betekenis is niet gekend. Wij bepalen in ons laboratorium pseudocholinesterase.

De bepaling van cholinesterase in serum is aangewezen als test van de leverfunctie, als indicator van vergiftiging door insekticiden en voor het opsporen van patiŽnten met atypische vormen van dit enzyme. Normale waarden gaan in ons laboratorium van 4,65 tot 10,65 U/ml, en deze waarden zijn bij ťťn persoon vrij constant. Bij de geboorte zijn de waarden laag, maar ze lopen snel op en bereiken de volwassen waarde rond de tweede levensmaand.

Bepalen van cholinesterase is een gevoelige leverfunctietest. Een daling van 10% bij een bepaalde persoon wijst (in afwezigheid van inhibitoren) op verminderde synthese in de lever. Bij acute of langdurige chronische hepatitis ziet men 30 tot 50 % daling van de activiteit. Gevorderde cirrose of levermetastasen veroorzaken een daling van 50 tot 70 % van de normale activiteit. Bij milde vormen van chronische hepatitis, bij lichte cirrose (zonder zware aantasting van de leverfunctie) vindt men praktisch normale waarden. Ook bij obstructieve icterus blijven de waarden normaal.

Vele organische insekticiden (Parathionį enz.) inhiberen de cholinesterase activiteit. Vooral land- en tuinbouwers zijn blootgesteld aan contact met deze giften. Een asymptomatische vergiftiging (door contact met de huid, de slijmvliezen of door inhalatie) kan reeds een verlaging van 40 % van de enzymeactiviteit meebrengen. Bij een daling van 80 % ziet men ernstige neuromusculaire tekens. Bij zware vergiftigingen vindt men geen enzymeactiviteit.

Succinylcholine (Suxamethoniumį, Myoplegineį) lijkt erg op acetylcholine, en het wordt ook gehydroliseerd door cholinesterase. PatiŽnten met een lage enzymeactiviteit, of patiŽnten met atypische vormen van het enzyme, breken dit medicament niet snel genoeg af, en dit kan aanleiding geven tot verlengde apnee. Men raadt daarom aan de cholinesterase activiteit te bepalen bij patiŽnten die succinylcholine zullen toegediend krijgen. Verlaagde waarden (verworven of aangeboren) vormen een tegenindicatie voor de toediening van succinylcholine. Atypische varianten van cholinesterase (aangeboren) kunnen hiermee niŤt uitgesloten worden: hiervoor is de bepaling van de enzymeactiviteit na inhibitie met dibucaine of fluoride nodig. Deze bepaling kan voorlopig nog niet uitgevoerd worden in ons laboratorium.

Verlaagde waarde van cholinesterase kan ook gevonden worden bij acute infecties, longembolen, spierdystrofie, myocard infarct, chronische nierinsufficiŽntie en zwangerschap. Ook na heelkundige ingrepen kan er een tijdelijke onderdrukking van de cholinesterase activiteit zijn.

 

9. Aldolase (ALD)

Komt in alle cellen in mindere mate voor, maar toch hoofdzakelijk in skelet en hartspier. Ook de lever bevat matige hoeveelheden aldolase.
Stijging komt voor bij spieraandoeningen, leverziekten, hartinfarct. Het biedt evenwel weinig bijkomende informatie in de meeste gevallen.

Dit onderzoek wordt NIET meer uitgevoerd.

 

10. Leucine Amino Peptidase (LAP)

LAP komt voor in pancreas, lever en duodenum. Zijn bepaling kan soms nuttig zijn: het is zeer specifiek voor hepato-biliaire aandoeningen.

 

 

 

 

klik hier voor een printvriendelijke versie

Klik hier voor een printvriendelijke versie van deze pagina

Download een WORD versie

Download een Word-versie van deze pagina

Terug naar hoofdmenu

Hoofdmenu


Anti-Spam Knop. Schrijf het e-mail adres op, voordat u op de knop drukt
 


 

valid html 4.01 Correct CSS!