Zebravis als concurrent van de labmuis

Medische labs kunnen een deel van hun muizenkooien inruilen voor aquaria, als het aan zebravisonderzoekers ligt. Met een nieuwe Utrechtse techniek is het uitschakelen van menselijke ziektegenen in de zebravis een fluitje van een cent.

door Martine Segers, gepubliceerd in Bionieuws, 20 juli 2002

De zebravis is de fruitvlieg onder de gewervelde dieren. De kleine flitsende visjes overleven prima in een simpele aquariumbak. In het Hubrecht Laboratorium in Utrecht zwemmen er tienduizenden rond in zulke kleine bakken. De vrouwtjes produceren honderden eitjes tegelijk en de mannetjes bevruchten die uitwendig. Dat levert goed te bestuderen doorzichtige embryo's op, waarin je na vijf dagen zelfs een hartje ziet kloppen en bloed door de vaten ziet stromen.

De zebravis heeft last van veel dezelfde soort ziektes als mensen, zoals kanker, geboortedefecten, spierziektes en infectieziektes. Kankerweefsels bij mensen en vissen lijken bijvoorbeeld visueel sterk op elkaar. Al komt borstkanker natuurlijk alleen maar voor bij zoogdieren.


Zebravisembryo van zestien uur oud
foto's: Hubrechtlab, Utrecht

'Een mens is weliswaar geen vis, maar wel een variatie op hetzelfde thema’, meent prof.dr. Ronald Plasterk van het Hubrecht Laboratorium in Utrecht. Een zebravis heeft ogen, een hart, een lever, een maag, huid, een zenuwstelsel en een wervelkolom, net als wij mensen. Het is ook het eerste dier in de evolutie dat een immuunsysteem heeft.

De vis heeft veel dezelfde overeenkomsten met de mens als de muis. ‘De zebravis is in het laboratorium echter minstens tien keer zo goedkoop en makkelijk te houden als de muis’, stelt Plasterk. De overheid stimuleert bovendien om experimenten met zo laag mogelijke dieren te doen. ‘Ik vind het zelf ook minder vervelend om een vis dood te maken dan een muis. Doordat vissen uitwendige embryo's hebben, hoef je ook minder volwassen dieren te doden.’

1200 euro

Ondanks die praktische en ethische voordelen, moet de echte opmars van de zebravis in de medische genetica nog beginnen. Tot nu toe is de zebravis eigenlijk vooral populair bij embryogenese-onderzoekers. Voor veel medische genetici was de genetische trukendoos voor zebravissen nog te armzalig.

Maar dat verandert. In rap tempo wordt in Engeland momenteel het genoom van de uit India en Burma afkomstige vis ontrafeld. En die informatie is volledig openbaar. Veel zebravisgenen zijn al op internet te vinden. Medische biologen komen ze al zeer regelmatig in databases tegen tijdens hun zoektocht naar homologen van allerlei ziektegenen.

Bovendien heeft drs. Erno Wienholds uit Plasterks onderzoeksgroep een relatief eenvoudige methode ontwikkeld om een specifiek gen uit te schakelen in een zebravis. Dat is een handig hulpmiddel in de zoektocht naar de functie van een gen en hun rol in ziektes. Begin juli publiceerde Science zijn artikel waarin hij beschrijft hoe hij een gen uitschakelde waardoor het immuunsysteem van de vis plat komt te liggen.

Het maken van knock-out zebravissen is met de nieuwe techniek flink goedkoper dan het maken van een knock-out muis. Uiteindelijk moet je voor 1200 euro een gen in vis kunnen uitschakelen, schat Wienholds.

‘Je hoeft eigenlijk alleen de sequentie te kennen van het gen dat je wilt uitschakelen’, vertelt Plasterk. ‘Weten waar het ligt op het genoom is niet nodig.’ Wienholds schakelt genen namelijk uit door gericht te zoeken naar random mutaties die hij met een mutagene chemische stof opwekt in een groot aantal zebravissen (zie kader).

Volgens de definitie zijn de vissen zelfs niet genetisch gemodificeerd en dat scheelt een hoop papierwerk. ‘Daarom hebben we bijvoorbeeld geen zorgen over veiligheidsaspecten van recombinant DNA-onderzoek; we hoeven geen goedkeuring van de Cogem te krijgen’, aldus Plasterk.

En zo wordt de zebravis nu wel een geduchte concurrent van de labmuis, denkt Plasterk. ‘Ik verwacht dat onze knock-out techniek een grote zuigende werking zal hebben richting het zebraonderzoeksveld.’ Tot voor kort piekerde bijvoorbeeld immunoloog en spinozaprijswinnaar prof.dr. Hans Clevers er niet over om aan de zebravis te gaan werken. ‘En nu gaan we waarschijnlijk samen met hem het APC-gen in zebravis uitschakelen om de rol van dit gen bij het ontstaan van darmkanker verder te ontrafelen.’

‘Een knock-out vis maken kan je bovendien op basis van je lopende budget doen’, vult dr.ir. Freek van Eeden aan, die op het Hubrechtlab de embryogenese van de zebravis bestudeert. ‘Terwijl je voor het maken van een nieuwe knock-out muis een serieuze projectaanvraag moet doen.’

Van Eeden speculeert ook dat het nu mogelijk wordt om een aantal goed geconserveerde genen waar niets van bekend is onder de loep te nemen. ‘Bij een muis zou het veel te duur zijn om er daar een paar van uit te schakelen, maar als het bij zebravissen echt goedkoop wordt kun je dat wel eens proberen.’

Missiewerk

Op de Universiteit Leiden verricht zebravisonderzoeker prof.dr. Herman Spaink missiewerk voor de zebravis. Na een enthousiaste lezing voor zo'n dertig onderzoekers voor het Leids Universitair Medisch Centrum vertelt hij dat de mens en de zebravis op moleculair niveau zo vreselijk veel op elkaar lijken dat het verschil soms amper te zien is.

Spaink denkt dat er veel onnodige experimenten met muizen plaatsvinden. Volgens hem is een groot deel van het muizenonderzoek ook in zebravissen mogelijk, misschien wel 90 procent. 'Van homologen van menselijke ziektegenen kan je eerst in de zebravis goed uitzoeken in welke pathways ze een rol spelen en met welke eiwitten het genproduct een interactie aangaat. Weet je dat allemaal, dan kan je heel gericht onderzoek doen in de muis.'

'De zebravis zal de muis nooit volledig vervangen', vervolgt Spaink. 'Medicijnen wil je echt wel eerst op muizen testen. Maar er worden nu duizenden medicijnen getest op muizen die niet blijken te werken.' Een groot deel daarvan had je ook eerst op zebravissen kunnen testen. En nog makkelijker ook. Zo gebruikt het Duitse bedrijf Artemis-pharmaceuticals microtiterplaten vol met zebravisembryo's om uit te zoeken welke fysiologische effecten mogelijke nieuwe medische stoffen hebben in gewervelde dieren. Ook de toxische effecten van een mogelijk nieuw medicijn komen zo snel boven water.

Toch betwijfelt Spaink of de muizenwereld zich spoedig laat overtuigen van de ethische en financiële voordelen van de zebravis.

De nieuwe knock-out technologie is in de zebraviswereld in ieder geval niet onopgemerkt gebleven. Plasterk heeft het gevoel dat de geschiedenis zich herhaalt. ‘Bij C. Elegans, het diertje waar genetisch alles mee kon, konden onderzoekers ironisch genoeg lange tijd niet een specifiek gen uitschakelen. Technisch bleek dat voor ons een kleine stap.' Toch had zijn groep er een enorme impact mee op het hele onderzoeksveld dat vooral bevolkt werd door klassieke genetici.

'Wij waren de DNA-wizards die trucs bedachten waar andere mee konden werken. Dat heeft ons veel bezoek opgeleverd. En dat gebeurt nu weer', vervolgt Plasterk. 'Eigenlijk is de knock-out zebravis het werk van slechts één derdejaars aio, een goede weliswaar. Maar de aanvoerders van het zebraveld komen ons nu met de hoed in de hand om hulp vragen.’





'Biologen onderschatten kracht van robotiseren'

‘Onze techniek is eigenlijk heel simpel’, stelt drs. Erno Wienholds. Met de mutagene stof ENU wekt hij volstrekt willekeurige mutaties op in het genoom van de zebravis en dan gaat hij slim zoeken naar de vissen waar toevallig het gewenste gen is uitgeschakeld. De kracht van de Utrechtse techniek is dat hij dat niet bij een paar vissen deed, maar bij meer dan 2500.

Voor die zoektocht gebruikt Wienholds het vissen-DNA dat hij uit sperma van de vissen haalt of isoleert uit een klein stukje afgeknipte vin. Hij vult vervolgens de putjes op microtiterplaten met het complete DNA van elk van de 2500 vissen. En dan mag de robot aan de slag. Via de PCR-techniek probeert die het gezochte gen te vermenigvuldigen. Een andere machine kan deze genen vervolgens sequencen, waarna met de computer makkelijk te bepalen is welke vissen een gemuteerd gen hebben dat niet meer naar behoren functioneert.

'Elke onderzoeker kan mutagene stoffen toedienen aan zebravissen en het sequencen is ook simpel', vertelt Wienholds. 'Er is een apparaat dat dat voor je doet en waarvoor allerlei kitjes te koop zijn met de juiste componenten.' Om het goedkoop te houden moet je elke proef wel in kleine volumes uitvoeren. ‘Wij denken dat onze techniek de standaard techniek wordt die iedereen in het veld gaat gebruiken.’

Biologen onderschatten nog steeds hoeveel er te winnen is met het paralelliseren, minituriariseren, robotiseren en het geautomatiseerd verwerken van gegevens, meent Plasterk. ‘Biologen zijn erg gewend om een proef te doen met twee buisjes, het experiment en de controle. Terwijl wij een proef doen met vijfduizend buisjes.’ ‘En maar één daarvan is positief’, vult Wienholds aan.

De Utrechtse techniek verschilt 180 graden met die bij de muis, waar het gen in een stamcel gericht wordt uitgeschakeld via homologe recombinatie. Daarna stoppen onderzoekers die cel in een embryo tussen de andere cellen in de hoop dat er in de volgende generatie muizen bij minstens één muis het gen in alle cellen is uitgeschakeld.

Nu er een bank met gemuteerde vissen aanwezig is, kost het maar een maand om de gewenste knock-out vis te vinden. Een deel van die tijd is nodig om een goede PCR-primers voor je gen te vinden. Inteeltkruisingen leveren vervolgens in zes maanden homozygote knock-out vissen. ‘We hebben inmiddels uit stukjes vin van zevenduizend vissen genoeg DNA in de diepvries zitten om te zoeken naar 200 verschillende knock-outs’, zegt Wienholds.

© Martine Segers