Zicht op grote eiwitten steeds helderder

Nobelprijs Chemie 2002

Massaspectrometers identificeren wereldwijd in een enorm tempo eiwitten. NMR-apparaten onthullen steeds meer over ruimtelijke structuren. Zonder deze twee Nobelprijswinnende technieken had proteomics geen wetenschappelijke hype kunnen worden.

door Martine Segers, gepubliceerd in Bionieuws, 9 november 2002

Welke eiwitten bevat een tumorcel en in welke hoeveelheden? Wat is er anders dan in een gezonde cel? En wat voor eiwitten gebruiken ziekteverwekkers als malaria en tuberculose in hun strijd? Of wat is op eiwitniveau het verschil tussen twee griepvarianten?

Nog niet zo lang geleden was het werken aan deze vragen door het scheiden, identificeren en karakteriseren van alle eiwitten in een weefsel, bloed of urine onbegonnen werk. Voor eiwitten bestaat er geen amplificatiemethode als PCR. Onderzoekers moeten het daarom vaak doen met de hoeveelheid die aanwezig is in een spotje op de scheidingsgel.

De techniek die er dit jaar met de Nobelprijs voor de Chemie van doorgaat, het snel 'wegen' van kleine hoeveelheden eiwitten in een massaspectrometer, biedt sinds kort uitkomst. In combinatie met betere scheidingsmethodes is een steeds groter percentage van de eiwitten in een complex mengsel snel te identificeren.

Spectra vol met piekjes of vlekjes waren lange tijd voorbehouden aan de chemici. Al sinds halverwege vorige eeuw helderen zij met massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) structuurformules en driedimensionale structuren van onbekende chemicaliën op.

De drie Nobelprijswinnaars voor de Chemie van dit jaar kregen voor elkaar wat biologen lang voor onmogelijk hielden. Ze maakten deze krachtige chemische analysemethoden geschikt om ook aan biologische macromoleculen te meten. 'Eind jaren tachtig was het al heroïsch dat je moleculen van 1000 à 2000 Dalton kon analyseren met de massaspectrometer', vertelt de Leidse deeltijdhoogleraar en manager-director van TNO Pharma, dr. Jan van der Greef. Nu heeft de Universiteit Utrecht het onofficieuze wereldrecord van 1,53 miljoen Dalton. 'Het is gewoon geworden, maar niemand verwachtte destijds dat je met massaspectroscopie ooit grote eiwitten kon analyseren.'

Vreemde eend

Het Nobelprijscomité eert de Amerikaan John Fenn (85), die zeker tot zijn tachtigste nog lezingen gaf op massaspectrometriecongressen. Hij krijgt de prijs voor zijn methode om eiwitten in hele kleine vloeistofdruppels in een elektrisch veld te ioniseren en daarna als het ware droog te föhnen. Ionisatie van eiwitten was tot dan toe de ontbrekende schakel om eiwitten in een massaspectrometer te kunnen onderzoeken. Ionisatie is nodig omdat een massaspectrometer het gewicht van een stof bepaald door ze als geladen deeltje in een vacuümkamer te versnellen. Uit de plaats waarop het ion landt is de massa te bepalen.

'Fenn ontwikkelde een milde ionisatiemethode waarbij het eiwit in een fysiologische buffer geïoniseerd wordt en zelfs niet-chemische bindingen tussen eiwitten in tact blijven', vertelt de Utrechtse hoogleraar, dr. Albert Heck. Dat maakt het ook mogelijk eiwit-eiwitinteracties te bestuderen. Twee eiwitten die samen een complex vormen geven namelijk pieken van een hoger gewicht. Zelfs ribosomen en virussen zijn met deze methode te 'wegen'.

De Japanner Koichi Tanaka (43) krijgt de Nobelprijs voor een andere manier van ioniseren, soft laser desorption. Door de eiwitten in een matrix te plaatsen bleek het mogelijk eiwitten met een laserstraal te ioniseren, zonder het hele eiwit kapot te schieten. Na zijn uitvinding is Tanaka bij het bedrijf Shimadzu blijven werken, weet Heck die hem van de zomer nog persoonlijk commentaar gaf op hun nieuwe massaspectrometer. 'Hij is een beetje een vreemde eend in de bijt. Hij heeft voor een Nobelprijswinnaar een opmerkelijk korte publicatielijst.'

Brokstukken

'Massaspectrometrie is een hele gevoelige methode', vertelt Heck. 'Je hebt soms al genoeg aan de hoeveelheid eiwit die in één cel zit. Bovendien kan je een spectrum van zo'n vijftig peptides in minder dan een seconde opnemen.'

Eiwitten identificeren is mogelijk door brokstukken heel nauwkeurig te wegen. Daarvoor knip je een eiwit op specifieke plaatsen in stukken met restrictie-enzymen. De weegresultaten leveren een unieke vingerafdruk van een eiwit. Voor identificatie maak je een virtuele afdruk. Die ontstaat door op de computer de eiwitten van elk gen van een gesequenced genoom met dezelfde restrictie-enzymen virtueel in stukken te knippen.

Je kunt ook verschil in concentraties meten. 'Bij de vergelijking tussen zieke en gezonde weefsels leveren die verschillen potentiële drugstargets', vertelt Van der Greef. 'Met massaspectrometrie kunnen we nu heel onbevangen met een holistische blik naar veranderingen in grote hoeveelheden eiwitten in een cel kijken. En dan zie je met patroonherkenningssoftware dat ziektes bijvoorbeeld niet met slechts één eiwitmarker te beschrijven zijn.'

Ook aan fundamenteel structuur-biologisch onderzoek kan massaspectrometrie een bijdrage leveren, stelt Heck. Je kunt er mee bepalen of basische aminozuren aan de buitenkant of aan de binnenkant van het eiwit zitten, door van een eiwit met een bekende massa de lading te bepalen. Tijdens het ionisatieproces kunnen basische groepen aan de buitenkant van het eiwit namelijk een positief geladen proton opnemen, degene die midden in een eiwit zitten niet. Op deze manier zijn bijvoorbeeld conformatieveranderingen onder invloed van metaalbindingen zichtbaar te maken.

Ook modificaties die de cel op een eiwit aanbrengt, zijn op te sporen. Aan een enzym dat 80 Da zwaarder is dan gedacht, heeft de cel bijvoorbeeld een fosfaatgroep gehangen.

Prioneiwit

Onderzoekers die micro- tot milligrammen eiwit kunnen kweken krijgen meer informatie met de techniek van de derde Nobelprijswinnaar, de Zwitser Kurt Wüthrich (64) van de ETH Zürich en het Scripps Research Institute in de VS. Hij krijgt de prijs voor zijn baanbrekende werk aan NMR-analysemethodes waarmee de 3D-structuur van grote biomoleculen te achterhalen is, een lastige klus voor grote moleculen die een grasveld aan piekjes opleveren. Hij pluisde uit hoe je kunt zien hoe individuele atomen in grote eiwitten elkaars signaal beïnvloeden via hun spins, kleine magneetjes die in elkaars magneetveld zitten.

Met Wüthrichs methode is de structuur van een eiwit te tekenen door de afstand tussen een aantal atomen in een eiwit te bepalen. Net zoals je een huis kunt tekenen als je alle afmetingen kent.

Bovendien liet de kersverse Nobelprijswinnaar ook zelf met NMR zien dat het prioneiwit een gestructureerd, gevouwen deel heeft en een ongevouwen, zwabberend deel. En hij gaat nu niet op zijn lauweren rusten, denkt de Nijmeegse hoogleraar dr. Cees Hilbers, hij blijft doorgaan met zijn onderzoek.

Voor grote eiwitcomplexen is de structuuropheldering met NMR lastiger dan met X-ray kristallografie, stelt Hilbers. Met NMR krijg je echter informatie over individuele atomen onder min of meer fysiologische condities. Het grote voordeel is dat je bewegende delen kunt 'zien' en bijvoorbeeld de vorming van eiwitcomplexen uit subunits in stappen kunt volgen.

Van potentiële medicijnen is redelijk eenvoudig te zien of ze aan een receptor binden. Daarna zijn ook de bindingsconstanten en de levensduur van het complex te bepalen.

Je kunt ook het vouwingsproces bestuderen door de vouwing van een eiwit op een aantal momenten stil te leggen. Dat kan door het vouwende eiwit af te koelen of bijvoorbeeld door zout toe te voegen. Op dezelfde manier is ook te onderzoeken hoe eiwitten via dynamische herkenningsprocessen aan bepaalde genen binden, hoopt Hilbers, die dit type onderzoek zelf van de grond probeert te tillen. Onderzoek dat dertig jaar geleden ondenkbaar was. 'Toen zat iedereen nog met zijn handen in het haar bij de vraag: hoe komen we meer te weten over moleculen met meer dan een paar duizend atomen.'

© Martine Segers